sábado, 12 de dezembro de 2015

Drosophila: da UFV à UNIFEI

Eu estudo Ciências Biológicas na UFV, e esse período fiz a matéria de Laboratório de Genética. Entre seminários, aulas teóricas e aulas práticas, tivemos que fazer um experimento com Drosophila. As drosófilas, ou moscas-da-banana, da-fruta, do-vinagre ou como mais você quiser chamar, são moscas (Insecta, Diptera, Drosophilidae) que tem o ciclo de vida muito curto (em 10 dias elas passam de ovo à adulto fértil), dimorfismo sexual (as fêmeas são visivelmente maiores e seu abdome é diferente dos machos) e baixo custo de manutenção (dá pra criar centenas em um pote com um meio de cultura baratíssimo de fazer). Graças a essas características, e ao seu histórico, são usadas até hoje como organismo modelo para o estudo de genética e hereditariedade, além de vários outros estudos (embriologia, etc etc).
E eu nasci em Itajubá, onde fica a UNIFEI, que, com seu novíssimo curso de Ciências Biológicas, ainda não conta com um laboratório de drosófilas. Por causa disso, uma professora da UNIFEI me pediu para levar as linhagens puras da UFV para ela. Para fazer experimentos com essas moscas, para estudar as Leis de Mendel por exemplo, a primeira coisa que você precisa é de linhagens puras. Porque não adianta nada sair cruzando seus bichos se você não souber exatamente os genes que cada um deles carrega. A UFV possui algumas linhagens puras de drosófila há algum tempo, assim como outras universidades do Brasil, e é com elas que fazemos experimentos.

Durante a disciplina, minha equipe fez o cruzamento entre moscas selvagem e taxi. Selvagem é o nome dado para qualquer característica "normal", ou seja, a mais encontrada na natureza. As moscas taxi, por outro lado, tem as asas mais abertas do que o normal, em um ângulo de ~70º.

Drosophila fêmea selvagem

Drosophila macho selvagem
Drosophila taxi
Nos nossos experimentos, fizemos cruzamentos entre moscas selvagem e taxi para ver como seria seus filhos e netos. De acordo com a teoria, os filhos deveriam ser 100% selvagem, e os netos deveriam ser 25% taxi e 75% selvagem. Porém, por vários motivos, a quantidade de moscas taxi foi muito, muito inferior a 25%.

Independente do resultado estar de acordo com a teoria ou não, aprendemos muito sobre como lidar com as drosófilas, sobre genética, sobre experimentação, relatórios e estatísticas. E, justamente por essa experiência ter sido tão legal, me esforcei para permitir que mais alunos de Biologia pudessem ter essa experiência.

No dia 7 de dezembro, um dia antes de viajar de volta para casa, eu passei a noite fazendo meu primeiro meio de cultura de Drosophila. Seguindo uma receita que eu peguei de uns veteranos, a mesma receita que estava no relatório entregue ao professor, fiz.

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Preparo do meio de cultura (Do relatório dos veteranos)



Para preparar o meio de cultura efetuam-se duas misturas em separado:

            Mistura I - Ágar 18g
                              Água 875mL
                              Mel   125mL

            Mistura II - Fubá 125g
                               Fermento 50g
                               Água 250 mL

Em um recipiente, dissolva o ágar em água fria, agite bem e leve ao fogo. Adicione o mel e agite bem até levantar fervura. Em outro recipiente misture muito bem o fubá e o fermento Fleischmann com água, até que se dissolva.
Adicione a mistura II ao recipiente da mistura I quando esta estiver fervendo e continue agitando sempre, até ficar moderadamente pastoso. Deixe esfriar durante 5 minutos, adicione 10 ml de solução de Nipagin, misture bem e antes que o meio de cultura se solidifique, distribua em cada tubo de cultura um volume que ocupe cerca de 1-2cm de altura.
Antes dos tubos de cultura receberem as moscas, introduza nos mesmos uma fita de papel de filtro, a qual é previamente embebida na solução alcoólica de Nipagin a 10%. Esta fita será dobrada em V e fixada no meio de cultura com auxílio de uma espátula. Sua função é absorver o excesso de umidade e servir de pouso para as moscas.
Finalmente, adicione um pouco de fermento Fleischmann fresco sobre o meio de cultura e vede cada tubo com uma rolha de algodão cardado.

Não dá para falar que eu segui a receita, mas que eu me inspirei nela, eu me inspirei.

Preparo do meio de cultura (Minha primeira tentativa)


Para preparar o meio de cultura efetuam-se duas misturas em separado:

            Mistura I - Gelatina sem sabor 12g
                              Água 875mL
                              Mel   125mL

            Mistura II - Fubá 125g
                               Fermento biológico Fleishmann 30g
                               Água 250 mL

Na panela, despejei a água, a gelatina sem sabor e o mel. Graças a acontecimentos na república, minha gelatina sem sabor incolor tinha sido usada, e eu precisei usar uma vermelha no lugar. Coloquei no fogo até ferver. Em um outro recipiente, coloquei o fubá, os três pacotes de fermento biológico e a água, e mexi até dissolver bem. Depois que a mistura I ferveu, adicionei a mistura II, e fiquei mexendo sobre o fogo por um bom tempo. De tempos em tempos, tirava um pouco e colocava em um pote de isopor e deixava esfriar, para ver se estava consistente o suficiente para solidificar. Tem que tomar cuidado para o meio de cultura não ficar mole demais, pois se isso acontecer as drosófilas podem ficar presas nele e morrer. Depois que achei o meio de cultura sólido o suficiente, parei de cozinhar e deixei esfriar.
Como não encontrei o fungicida em nenhuma farmácia, simplesmente não coloquei. O que descobri depois que foi uma péssima coisa a se fazer.
Deixei o meio de cultura esfriar, e coloquei ele em garrafas PET de 2l e 2,5l previamente lavadas e cortadas de modo a tirar a boca em funil, deixando a boca bem larga. Coloquei um filtro de café de papel dobrado em cada uma delas, para secar o meio de cultura e evitar a umidade. O filtro de papel também serve para o pouso das drosófilas.
Depois, joguei um pouquinho de fubá em cima de cada meio de cultura, por capricho. Tampei cada garrafa pet com um pedaço de pano e prendi com um elástico. 
 
No dia seguinte, fui até o Laboratório de Drosophila com o professor e peguei as seis linhagens puras que ele tinha disponíveis: taxi, ebony, vestigial, white, taxi ebony, e selvagem. Coloquei cada uma em um pote. Coloquei as seis em uma caixa de papelão, tampei, e peguei o ônibus. Ao chegar em casa depois de 14 horas de viagem, de ônibus de madrugada, espera na rodoviária, e até uma breve chuva por ter que trocar de ônibus no meio da estrada, que felicidade ver as drosófilas ainda vivas, todas as linhagens.

Deixei as garrafas pet sobre uma mesa, bem tampadas com tecido e elástico, e percebi que algumas drosófilas selvagens apareciam do lado de fora dos potes. Fiquei me perguntando se elas são atraídas pelo cheiro do meio de cultura, pelos ferormônios das drosófilas presas, ou pelos dois.

No dia 10 já começaram a aparecer fungos no meio de cultura avermelhado. Ainda não fiz Microbiologia, então nem sei quais fungos eram, Mas tinha preto, filamentoso, branco, todos os tipos. Então decidi que eu precisaria fazer mais meio de cultura, dessa vez com fungicida, para passar as drosófilas para a professora.

Dessa vez decidi seguir a receita que encontrei no software GBOL, desenvolvido e recomendado por professores da UFV.

O Nipargim eu comprei em uma farmácia de manipulação (10g a R$16,00) e pedi para embalarem 1g em cada sachê.

Receita do GBOL

Cultivo em Laboratório

Recipientes
As drosófilas são cultivadas em laboratórios dentro de frascos de vidros, contendo meio de cultura, para a sua multiplicação e sobrevivência. Estes frascos devem ser, de preferência, alongados e com a boca estreita. 
Meio de cultura para drosófilas
São utilizados os seguintes ingredientes no preparo do meio para cultivo da drosófila em laboratório :
·        ágar 18 gramas
·        água 1,255 litros
·        açúcar 41,8 gramas
·        trigo 125 gramas
·        nipagim 10ml (ou solução de parahidroxibenzoato de metila) - fungicida
Esterilização dos frascos:
               Os frascos a serem utilizados como recipientes do meio de cultura devem ser previamente esterilizados em autoclaves.

Preparo da Solução de Fungicida
               A solução de fungicida é preparada com os seguintes produtos:
·        Solução de Parahidroxibenzoato de metila a 10%:
·        10 gramas de Parahidroxibenzoato de metila
·        100 ml de álcool

Preparo:
Pesar os ingredientes, dissolver com um pouco de água o ágar e, com o restante, o trigo. Acrescentar o açúcar e colocar a mistura no fogo mexendo durante todo o tempo para não agarrar na vasilha. Esperar ferver e engrossar um pouco, apagar o fogo e quando a temperatura tiver abaixado um pouco acrescentar o fungicida (nipagim ou parahidrixibenzoato de metila).  Virar com uma concha, ou similar,  o meio de cultura nos frascos já devidamente esterilizados, tomando-se o cuidado de não  sujar as bordas e laterais dos frascos.
Deixar os frascos, contendo o  meio de cultura, tampados. Secar por dois dias até que estejam sem umidade aparente. Quando for utilizar os meios acrescentar uma pequena porção de fermento químico em grãos. Os meios não utilizados de imediato devem ser conservados em geladeira e retirados dela, algumas horas antes de sua utilização.

Rendimento
O meio de cultura preparado é suficiente para cerca de 18 a 20 vidros
E, é claro, a minha receita ficou um pouco diferente da recomendada.

Minha receita, inspirada no GBOL

Recipientes
Comprei seis potes de vidro em uma loja de 1,99. Poderia ter usado potes de maionese usados, mas eu não ia achar seis potes de maionese vazios assim de um dia pro outro.
Meio de cultura para drosófilas
São utilizados os seguintes ingredientes no preparo do meio para cultivo da drosófila em laboratório :
·        gelatina incolor sem cor 24 gramas
·        água 1,250 litros
·        açúcar 80 gramas
·        farinha de trigo 125 gramas
·        nipagim 1g dissolvido em álcool - fungicida
·       
filtro de papel de café
·        fermento biológico Fleishmann
Esterilização dos frascos:
               Os potes a serem usados foram fervidos por cerca de 5 minutos, só por precaução.
Preparo da Solução de Fungicida
               A solução de fungicida foi preparada com os seguintes produtos:
·        1 grama de Parahidroxibenzoato de metila
·        Álcool o suficiente para diluir completamente essa grama (pouco mais de 10ml)

Preparo:
Pesar os ingredientes. Dissolver o trigo e a gelatina em água. Eu coloquei tudo de uma vez na panela, mas acho que seria melhor se tivesse dissolvido separadamente cada um em água, e jogado na panela já completamente dissolvido. Acrescentar o açúcar e colocar a mistura no fogo mexendo durante todo o tempo para não agarrar na vasilha. Acrescentas 30g de fermento biológico e misturar bem. Esperar ferver e engrossar bem, apagar o fogo e quando a temperatura tiver abaixado um pouco acrescentar o fungicida (nipagim ou parahidrixibenzoato de metila).  Colocar  o meio de cultura nos frascos já devidamente fervidos, tomando-se o cuidado de não  sujar as bordas e laterais dos frascos. Colocar
Deixar os frascos, contendo o  meio de cultura, tampados. Jogar um pouco de fermento biológico por cima do meio de cultura já solidificado. Colocar também filtro de papel dobrado no meio de cultura. Secar por dois dias até que estejam sem umidade aparente. Os meios não utilizados de imediato devem ser conservados em geladeira e retirados dela, algumas horas antes de sua utilização.

Rendimento
O meio de cultura preparado é suficiente para seis potes grandes, e o resto foi guardado em um pote de plástico pequeno.

Fiz meu meio de cultura, dessa vez com gelatina incolor, e ficou muito mais parecido com o meio de cultura que eu vi no laboratório da UFV. Decidi seguir a receita e deixar o meio de cultura descansar dois dias antes de passar as drosófilas para ele. Deixei as tampas somente encaixadas nos potes, não totalmente tampadas, o que foi uma má ideia, porque de manhã encontrei duas drosófilas dentro do pote. Soprei elas pra fora. O pote que tinha essas drosófilas selvagens - que provavelmente nem colocaram ovos, só foram atraídas pelo cheiro do meio de cultura mesmo - vai ser destinado para a linhagem pura de selvagem.

Como eu ia esperar para transportar as drosófilas, fiquei com medo dos fungos no meio de cultura antigo matar as drosófilas. Sobraram alguns cristais de nipagim no copo onde eu fiz a solução, e eu decidi usar eles para tentar matar os fungos do meio de cultura antigo. Joguei um poquinho de álcool no copo, para dissolver os cristais que sobraram, e com uma seringa joguei essa solução nos meios de cultura antigos, bem em cima dos fungos. No outro dia, eles pareciam ter diminuído, mas pode ter sido apenas por causa do álcool, e nem tanto por causa do nipagim. Não sei se esse composto tem o efeito de matar o fungo ou de apenas prevenir seu aparecimento. 

No dia 13 encontrei algumas larvas em três linhagens: white, taxi e selvagem. Dois dias depois e todas elas estão cheias de larvas.

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